母乳被公認為是嬰兒最理想的食物，最佳的營養(yǎng)來源，母乳已經檢測出至少含有400多種營養(yǎng)物質，其中的母乳低聚糖（HMOs）是人類母乳中的第三大固體組分，僅次于乳糖（55-70g/L）和脂肪（15-40g/L）， HMOs 是一類包含 200 多種不易消化且非營養(yǎng)性的低聚糖混合物，其具有重要的生物學功能，不僅對腸道病原微生物起到抗感染的作用，還能維持腸道微生態(tài)的平衡，更有利于嬰兒神經系統(tǒng)發(fā)育，并可降低免疫相關的非傳染性疾病的發(fā)生。目前嬰幼兒配方奶粉主要是用動物的乳為原料，特別是牛乳，而牛乳中HMOs的含量非常少，所以在配方奶粉中添加HMOs就非常有必要，這樣可以最大限度地減少配方奶粉喂養(yǎng)和母乳喂養(yǎng)嬰兒之間的發(fā)育差異，從而可能改善配方奶粉喂養(yǎng)嬰兒的整體健康狀況。而隨著國內監(jiān)管機構的公示和批準， HMOs現(xiàn)已被正式允許用于國內嬰幼兒配方奶粉，含有HMOs的嬰幼兒配方奶粉也陸續(xù)開始上市銷售。
國家衛(wèi)健委于2023年10月7日發(fā)布公告，正式批準母乳低聚糖（HMOs）中的2´-FL（2´-巖藻糖基乳糖）和LNnT（乳糖-N-新四糖）可作為食品營養(yǎng)強化劑應用于嬰幼兒配方奶粉、調制乳粉（兒童用)，以及特殊醫(yī)學嬰兒食品[1]。國家食品安全風險評估中心于2024年3月13日發(fā)布，擬征求意見的食品營養(yǎng)強化劑新品種中，涉及3´-SL（3´-唾液酸乳糖鈉鹽）和6´-SL（6´-唾液酸乳糖鈉鹽）均屬于HMOs[2]。這些品種原料的檢測方法均涉及電霧式檢測器（CAD）。
圖：CAD檢測器（左：Corona Veo 系列，右：Vanquish CAD系列）
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乳糖-N-新四糖CAD測定結果
1.1 依據(jù)公告文件方法，完成系統(tǒng)適應性測試，溶劑連續(xù)進樣至少五次，待液相色譜響應穩(wěn)定后在電霧式檢測器條件下進行系統(tǒng)適用性測試。滿足下表條件后可進行乳糖-N-新四糖及乳糖-N-新四糖果糖異構體含量測試，測定結果均可滿足系統(tǒng)適應性要求，結果見下表所示。
表1. 系統(tǒng)適用性要求及測試結果
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1.2校正曲線測定結果
乳糖-N-新四糖通過紫外檢測器測定，其線性校正曲線結果如下圖所示，從結果可知，乳糖-N-新四糖在160-240µg/mL濃度范圍內，強制過零點，通過一次線性擬合，結果良好，相關系數(shù)R2為0.99941，滿足＞0.995要求。
乳糖-N-新四糖果糖異構體通過CAD檢測器測定，其線性校正曲線結果如下圖所示，從結果可知，乳糖-N-新四糖果糖異構體在6-100µg/mL濃度范圍內，通過二次線性擬合，結果良好，相關系數(shù)R2為0.99996。
圖 乳糖-N-新四糖校正曲線
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圖 乳糖-N-新四糖果糖異構體校準曲線
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1.3定量限測定結果
對乳糖-N-新四糖果糖異構體的定量限進行考察，結果為6.0µg/mL。按標準中樣品濃度0.2 mg/mL計算，乳糖-N-新四糖果糖異構體的檢出濃度可達0.3%，高于當前標準公示1.0%限度要求，完全滿足原料質控的需求。
1.4實際樣品分析測定結果
運用本文方法，串聯(lián)紫外檢測器和CAD檢測器，完全可以滿足對不同批次營養(yǎng)強化劑乳糖-N-新四糖原料中乳糖-N-新四糖（紫外測定）和乳糖-N-新四糖果糖異構體（CAD測定）的含量同時測定的需求，乳糖-N-新四糖果糖異構體CAD結果和乳糖-N-新四糖紫外結果如下圖所示。
圖 原料中乳糖-N-新四糖果糖異構體測定結果（CAD）
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圖 原料中乳糖-N-新四糖測定結果（UV）
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2´-巖藻糖基乳糖原料CAD測定結果
依據(jù)公示方法，通過CAD檢測器及對應色譜方法，測定結果下圖所示，可滿足原料中2´-巖藻糖基乳糖原料中的D-乳糖和二巖藻糖基乳糖含量測定質控的需求。
圖 2’巖藻糖基乳糖樣品色譜圖
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3´-唾液酸乳糖鈉鹽&6´-唾液酸乳糖鈉鹽CAD測定結果
依據(jù)公示方法，通過CAD檢測器及對應色譜方法，結果如下圖所示，本方法適用于原料中3´-唾液酸乳糖鈉鹽及異構體3´-唾液酸乳果糖，6´-唾液酸乳糖鈉鹽和乳糖含量同時測定質控的需求。
圖 乳糖、3´-唾液酸乳糖鈉鹽&6´-唾液酸乳糖鈉鹽標品色譜圖（點擊查看大圖）
Summary
小結
通過紫外檢測器串聯(lián)電霧式檢測器（CAD）成功復現(xiàn)了母乳低聚糖中LNnT(乳糖-N-新四糖)當前公示的國家標準方法。雖然待測物沒有明顯的紫外吸收，但對于原料中含量較高的主成分，公示方法采用紫外檢測器末端吸收205nm進行測定，效果較為理想；而對于需要重點控制的主要雜質乳糖-N-新四糖果糖異構體，由于限度較低，公示標準采用了更加靈敏的CAD檢測器進行分析，方法學考察結果顯示，靈敏度和重現(xiàn)性均符合標準要求。
基于CAD檢測器對無/弱紫外吸收物質檢測的優(yōu)勢，其他類型的母乳低聚糖，如2´-FL（2´-巖藻糖基乳糖）、3´-SL（3´-唾液酸乳糖鈉鹽）及6´-SL（6´-唾液酸乳糖鈉鹽），也同樣適用。同時，本方法也可用于嬰幼兒配方奶粉、調制乳粉(兒童用)以及特殊醫(yī)學嬰兒食品中LNnT含量的測試，可作為相關行業(yè)分析人員進行該領域分析的重要參考。
參考文獻：
[1] 《關于桃膠等15種“三新食品”的公告》（2023年第8號），國家衛(wèi)生健康委，2023年9月22日.
[2] 關于公開征求羥基酪醇等7種食品添加劑新品種意見，國家食品安全風險評估中心，2024年3月13日.
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